BSA分析:GATK 4の使用(bwaを含む)

21045 ワード
注:バージョンが異なると、コマンドが一致しません.必ず対応するバージョンを使います.
GoogleアカウントGATK 3のダウンロードアドレスGATK 4の各バージョンにログインする必要があり、コマンドによっては変更があります.1.GATKのインストール、他人のチュートリアルテンセントクラウドを使用するチュートリアルGATK 4データ前処理変異検出(BWA+SAMtools+picard+GATK)bwa+samtools+picardtools+GATK call SNPプロセスは、私たちのサーバーのスラグのネットワーク問題のため、内容はすべて地元のwin 10にダウンロードした後、サーバーにアップロードします.サーバ構成:cpu 4個6コア2スレッド=48メモリ:396 G gatkはJavaプログラムで、ローカルにダウンロードして解凍すれば使用できます.win 10でIDMを使用してgatk 4をダウンロードする.0.10.1アドレス格納ディレクトリ
/home/chaim/disk/gatk/
unzip gatk4.0.10.1
cd gatk4.0.10.1/
chmod 777 gatk
./gatk --list          //  gatk

2.GATK4.0.10.1概要よく使われるpipelineは5種類あります
  • Germline SNPs+Indels種系SNP+Indel
  • Somatic SNVs+Indels体細胞単塩基突然変異
  • RNAseq SNPs + Indels
  • Germline CNVs種系コピー数変異(Copy numbervariations,CNVs)は主に1 kb以上のDNA断片の欠失、挿入、重複などを指す.一般に構造的変異
  • Somatic CNVs体細胞コピー数変異1、2、4、5はDNAシーケンシング分析に適し、3はRNAシーケンシング分析に適している.公式文書
  • 分析開始
    • GATK4.0全ゲノムと外現子群分析実戦
    ソフトウェア:
  • fastqc検出品質
  • fastq/trimmomatic品質管理
  • bwa対
  • samtoolフォーマット変換
    • データ格納場所
    すべてのデータ環境の前提は、/home/chaim/disk/BSA/ディレクトリにディレクトリファイルがあります.
    119-8-1 //119-8      1
-A23-16551278-1279119-8_combined_R1.fastq.gz
-A23-16551278-1279119-8_combined_R2.fastq.gz
119-8-2 //119-8      2
-A23-16551278-1279-119-8_combined_R1.fastq.gz
-A23-16551278-1279-119-8_combined_R2.fastq.gz
origin 
- B17SF2447-20_L1_358358.R1.clean.fastq_2.gz  
- B17SF2447-20_L2_358358.R1.clean.fastq.gz
- B17SF2447-20_L1_358358.R2.clean.fastq.gz
- B17SF2447-20_L2_358358.R2.clean.fastq.gz
//

    1.品質管理検査fastqc *.fastq.gz -t 8 -o fastqc_out/
    fastpのインストール
    wget http://opengene.org/fastp/fastp
chmod 755 fastp

    fastp品質管理データの使用
    ~~fastpはtrimmomaticより速く、効果が高いと言われています.一応信じる.
    ./fastp -i in.R1.fq.gz -o out.R1.fq.gz -I in.R2.fq.gz -O out.R2.fq.gz

    #     /BSA/119-8     119-8   
../origin/fastp -i ../119-8-1/A23-16551278-1279119-8_combined_R1.fastq.gz -o ./fastp_out/119-8_1.R1.clean.fastq.gz -I ../119-8-1/A23-16551278-1279119-8_combined_R2.fastq.gz -O ./fastp_out/119-8_1.R2.clean.fastq.gz -Q --thread=5 --length_required=50 --n_base_limit=6 --compression=6 &
 ../origin/fastp -i ../119-8-2/A23-16551278-1279-119-8_combined_R1.fastq.gz -o ./fastp_out/119-8_2.R1.clean.fastq.gz -I ../119-8-2/A23-16551278-1279-119-8_combined_R2.fastq.gz -O ./fastp_out/119-8_2.R2.clean.fastq.gz -Q --thread=5 --length_required=50 --n_base_limit=6 --compression=6 &

#   /BSA/origin/
./fastp -i ./B17SF2447-20_L1_358358.R1.clean.fastq.gz -o ./fastp_out/2447-20_L1$.R1.clean.fastq.gz -I ./B17SF2447-20_L1_358358.R2.clean.fastq.gz -O ./fastp_out/2447-20_L1.R2.clean.fastq.gz -Q --thread=5 --length_required=50 --n_base_limit=6 --compression=6 &

./fastp -i ./B17SF2447-20_L2_358358.R1.clean.fastq.gz -o ./fastp_out/2447-20_L2.R1.clean.fastq.gz -I ./B17SF2447-20_L2_358358.R2.clean.fastq.gz -O ./fastp_out/2447-20_L2.R2.clean.fastq.gz -Q --thread=5 --length_required=50 --n_base_limit=6 --compression=6 &

    fastpパラメータ参照アドレス-i R1両端シーケンシングデータを入力R 1端-o outputR1質量制御後出力R 1端-I R2入力R 2原始シーケンシングデータ-O outputR2質量制御後出力R 2端-Q質量フィルタ--thread=5無効設定スレッド数5 --length_required=50設定フィルタの最短シーケンス長50 bp --n_base_limit=6 1つのreadsにおけるNの回数が6より大きく、このreads --compression=6出力を破棄したgzipファイルの圧縮度合いは6,1−9であり、圧縮度合いは増大する.
    bwaフローパラメータbwaリファレンス1 bwaリファレンス2
    2.1. bwaインデックスファイルの作成
    /bwaのコマンドはnohupを使用しないでください.Nohupの出力情報はbwaによってターゲットファイルに出力され、後続のステップ/
    B 73シーケンスアドレス位置
    /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa /BSA/bwa/zm437 
     //    /BSA/bwa/
bwa index -a bwtsw -p zm437 /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa
    index -a bwtsw設定モード、大ゲノム-p zm437設定出力ファイル名に適合
    /#注意:ここの2.2.1と2.2.2の2つのステップのbwaは必ず同じバージョンのbwaを使用しなければなりません.そうしないと、後でエラーが発生します.
    2.2と2.3のどちらかを選択すればよい、2.3を使用することを提案する.bwaのmemの効率はより高く,より正確である.
    2.2 bwa入力readsファイルのSA座標を探す
    //    /BSA/bwa/
bwa  aln  zm437  read1.fq.gz  -l 30  -k 2  -t 8  -I  > read1.fq.gz.sai
bwa  aln  zm437  read2.fq.gz  -l 30  -k 2  -t 8  -I  > read2.fq.gz.sai

    // 4    2447-20  
bwa aln zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R1.clean.fastq.gz -l 30  -k 2  -t 8  -I >2447-20_L1.R1.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R2.clean.fastq.gz -l 30  -k 2  -t 8  -I >2447-20_L1.R2.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R1.clean.fastq.gz -l 30  -k 2  -t 8  -I >2447-20_L2.R1.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R2.clean.fastq.gz -l 30  -k 2  -t 8  -I >2447-20_L2.R2.fq.gz.sai &

// 4  119-8   
bwa aln zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_1.R1.clean.fastq.gz -l 30  -k 2  -t 8  -I >119-8_1.R1.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_1.R2.clean.fastq.gz -l 30  -k 2  -t 8  -I >119-8_1.R2.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_2.R1.clean.fastq.gz -l 30  -k 2  -t 8  -I >119-8_2.R1.fq.gz.sai &
bwa aln zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_2.R2.clean.fastq.gz -l 30  -k 2  -t 8  -I >119-8_2.R2.fq.gz.sai &

    2.2.2 sai回転sam
    bwa sampe -r "@RG\tID:\tLB:\tSM:\tPL:ILLUMINA"  read1.fq.gz.sai read2.fq.gz.sai read1.fq.gz read2.fq.gz > read.sam

    注記:SAMPLE_NAMEは、対応するサンプル名に置き換える必要があります.そうしないと、サンプルとして処理されます.
    //2447-20  
bwa sampe zm437 -r "@RG\tID:2447-20\tLB:B73\tSM:2447-20_L1\tPL:ILLUMINA" 2447-20_L1.R1.fq.gz.sai 2447-20_L1.R2.fq.gz.sai  ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R1.clean.fastq.gz ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R2.clean.fastq.gz >2447-20_L1.sam &
bwa sampe zm437 -r "@RG\tID:2447-20\tLB:B73\tSM:2447-20_L2\tPL:ILLUMINA" 2447-20_L2.R1.fq.gz.sai 2447-20_L2.R2.fq.gz.sai  ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R1.clean.fastq.gz ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R2.clean.fastq.gz >2447-20_L2.sam &

//119-8  
bwa sampe zm437 -r "@RG\tID:119-8\tLB:B73\tSM:119-8_1\tPL:ILLUMINA" 119-8_1.R1.fq.gz.sai 119-8_1.R2.fq.gz.sai ../119-8/fastp_out/119-8_1.R1.clean.fastq.gz ../119-8/fastp_out/119-8_1.R2.clean.fastq.gz >119-8_1.sam  &
bwa sampe zm437 -r "@RG\tID:119-8\tLB:B73\tSM:119-8_2\tPL:ILLUMINA" 119-8_2.R1.fq.gz.sai 119-8_2.R2.fq.gz.sai ../119-8/fastp_out/119-8_2.R1.clean.fastq.gz ../119-8/fastp_out/119-8_2.R2.clean.fastq.gz >119-8_2.sam  &

    2.3 BWAのmemの使用は、高速で一歩前進することができます.リファレンスアドレス(注意2.2と2.3、2つ選択すればよい、2.3を推奨)
    
#bwa mem   
/*     /home/chaim/disk/BSA/bwa/*/
/*zm437 B73     */
/*     -R         */
bwa mem -t 24 -M -P -R '@RG\tID:2447-20\tSM:2447-20\tLB:WES\tPL:Illumina' zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R1.clean.fastq.gz ../origin/fastp_out/2447-20_L1.R2.clean.fastq.gz >2447-20_L1.sam &
bwa mem -t 24 -M -P -R '@RG\tID:2447-20\tSM:2447-20\tLB:WES\tPL:Illumina' zm437 ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R1.clean.fastq.gz ../origin/fastp_out/2447-20_L2.R2.clean.fastq.gz >2447-20_L2.sam &
bwa mem -t 12 -M -P -R '@RG\tID:119-8\tSM:119-8\tLB:WES\tPL:Illumina' zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_1.R1.clean.fastq.gz ../119-8/fastp_out/119-8_1.R2.clean.fastq.gz >119-8_1.sam &
bwa mem -t 8 -M -P -R '@RG\tID:119-8\tSM:119-8\tLB:WES\tPL:Illumina' zm437 ../119-8/fastp_out/119-8_2.R1.clean.fastq.gz ../119-8/fastp_out/119-8_2.R2.clean.fastq.gz >119-8_2.sam &

    3.Samファイルの並べ替え(recorder)
    ダウンロードインストールの最新版picardは、パス/home/chaim/disk/BSA/bwa/に保存され、このパスでjava -jar picard.jar -hが実行され、picardに含まれるすべてのツールがリストされます.3.1インデックスシーケンスの構築nohup samtools faidx zm437 & 3.2 Samファイルの並べ替え
    java -jar picard.jar CreateSequenceDictionary R=/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa O=zm437.dict
java -jar picard.jar ReorderSam I=2447-20_L1.sam O=2447-20_L1.reordered.sam R=/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa &
java -jar picard.jar ReorderSam I=2447-20_L2.sam O=2447-20_L2.reordered.sam R=/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa &
java -jar picard.jar ReorderSam I=119-8_1.sam O=119-8_1.reordered.sam R=/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa 
java -jar picard.jar ReorderSam I=119-8_2.sam O=119-8_2.reordered.sam R=/home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa &

    4.samファイルをbamファイルに変換します.
    samtools view --threads 24 -bS 2447-20_L1.reordered.sam -o 2447-20_L1.bam &
samtools view --threads 24 -bS 2447-20_L2.reordered.sam -o 2447-20_L2.bam &
samtools view  --threads 8 -bS 119-8_1.reordered.sam -o 119-8_1.bam 
samtools view  --threads 8 -bS 119-8_2.reordered.sam -o 119-8_2.bam &

    5.bamファイルのsortソート
    java -jar picard.jar  SortSam INPUT=2447-20_L1.bam OUTPUT=2447-20_L1.sort.bam SORT_ORDER=coordinate &
java -Xmx48G -jar picard.jar  SortSam INPUT=2447-20_L2.bam OUTPUT=2447-20_L2.sort.bam SORT_ORDER=coordinate &
java -Xmx96G -jar picard.jar  SortSam INPUT=119-8_1.bam OUTPUT=119-8_1.sort.bam SORT_ORDER=coordinate
java -jar picard.jar  SortSam INPUT=119-8_2.bam OUTPUT=119-8_2.sort.bam SORT_ORDER=coordinate &

    6. Merge 
    \\         lane bam  。
java -jar picard.jar MergeSamFiles I=2447-20_L1.sort.bam I=2447-20_L2.sort.bam O=2447-20.bam &
java -jar picard.jar MergeSamFiles I=119-8_1.sort.bam I=119-8_2.sort.bam O=119-8.bam

    7. Duplicates Marking
    一般にRNA−seqはこのステップを必要とせず、chip−seq、dap−seq、call snpはこのステップを必要とする.具体的な原理シーケンシング原理はランダムに遮断され,理論的に2つの完全に同じreadが現れる確率は非常に低く,ライブラリの構築時にPCR増幅に偏向性があるため,完全に同じreadを示す.
    java -jar picard.jar MarkDuplicates REMOVE_DUPLICATES= false MAX_FILE_HANDLES_FOR_READ_ENDS_MAP=8000 INPUT=2447-20.bam OUTPUT=2447-20.repeatmark.bam METRICS_FILE=2447-20.bam.metrics
java -jar picard.jar MarkDuplicates REMOVE_DUPLICATES= false MAX_FILE_HANDLES_FOR_READ_ENDS_MAP=8000 INPUT=119-8.bam OUTPUT=119-8.repeatmark.bam METRICS_FILE=119-8.bam.metrics

    8.前のステップの結果を生成するインデックスファイル
    samtools index 2447-20.repeatmark.bam
samtools index 119-8.repeatmark.bam

    /#前のbwaのmemのRパラメータのため、私は第1回の実行時に完全に設定していないので、ここでヘッドファイルを2回変更する必要があります*/picardを使用してヘッドファイルID strを変更します:readsセットID番号を入力します;LB:readセットライブラリ名;PL:シーケンシングプラットフォーム(illunimaまたはsolid);PU:シーケンシングプラットフォームの下位単位名(runの名称);SM:サンプル名.
    java -Xmx96g -jar picard.jar AddOrReplaceReadGroups I=2447-20.repeatmark.bam O=2447-20.repeat.bam LB=lib2447-20 PL=illumina PU=2447-20 SM=2447-20 &
java -Xmx96g -jar picard.jar AddOrReplaceReadGroups I=119-8.repeatmark.bam O=119-8.repeat.bam LB=lib119-8 PL=illumina PU=119-8 SM=119-8 &

    /必ず手動でヘッダーファイルを追加しないでください.手動の後続は認識できません./
    9.Base (Quality Score) Recalibration
    Tools involved:BaseRecalibrator,Apply Recalibration,AnalyzeCovariates(optional)参照アドレスフロー参照アドレス塩基質量分数再較正(Base quality score recalibration,BQSR)は,機械学習により元の塩基の質量分数を調整する.2つのステップに分けられます.
  • 既存のsnpデータベースを用いて相関モデルを構築し、再較正テーブル
    • を生成する.
  • は、このモデルに従って元の塩基を調整し、非既知のSNP領域のみを調整する.パラメータリスト-R:参照ゲノム-I:入力BAMファイル--known-sites既知SNPのvcfファイル-O:出力リキャリブレーションテーブル
    • java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar BaseRecalibrator -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 2447-20.repeat.bam --known-sites /home/guo/maize/zm437/zea_mays_vcfsort.vcf -O 2447-20_recal_data.table &
java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ApplyBQSR -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 2447-20.repeat.bam -bqsr 2447-20_recal_data.table -O 2447-20_recal_reads.bam &

java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar BaseRecalibrator -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 119-8.repeat.bam --known-sites /home/guo/maize/zm437/zea_mays_vcfsort.vcf -O 119-8_recal_data.table &
java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ApplyBQSR -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 119-8.repeat.bam -bqsr 119-8_recal_data.table -O 119-8_recal_reads.bam &

    #上記で生成したbamファイルが使用可能かどうかを検出します.
    java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ValidateSamFile -I 2447-20_recal_reads.bam
java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ValidateSamFile -I 119-8_recal_reads.bam
    no errors foundが表示する場合、HaplotyCaller call SNP/Indelを使用することができる.
    二、GATK変異検出
    チュートリアルのアドレスの説明を参照してください.その後、24プロセスを使用することを表す-nt 24というパラメータが一部のコマンドで使用されます.各コマンドがマルチプロセスを開くわけではありません.gatk公式サイトでドキュメントを検索し、コマンドを検索した後、コマンドのAPIドキュメントでthreadを検索すると、マルチスレッドが使用できるかどうかをすばやく検索できます.(このステップV 4.1.4.0ではjavaのメモリ割り当ては16 gを超えないことが望ましいが、8 gで十分であることを提案する.hmmプロセスもポイント4-8個を少なく設定する.Javaメモリ設定が高すぎると、サーバのメモリ範囲でもエラーが発生し、メモリ割り当てが不足しているため途中でプログラムを削除し、途中で切ると同様に修復方法がある.picardは中断したgvcfファイルを修復する).raw vcfファイルを生成します(3-5日で実行できるのは、すべて大きなサーバです)パラメータは、HaplotypeCallerでgvcfファイルを生成してからCombineGVCFsを実行することを示します.java -Xmx96G -jar/home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.JAr#Xmx 96 Gで使用する最大メモリHaplotyCaller#HaplotyCallerモードを使用し、食事構成-R/home/chaim/disk/BSA/bwa/zm 437#参照B 73ゲノム-I 2447-20.repeatmark.Bam#複数サンプルの場合-I sample 1.bam -I sample2.bam--dbsnp zm 437 vcf#B 73参照snp-stand_emit_conf 10 -stand_call_conf 30 -O 2447-20.vcf 1.1 Gvcfファイルを生成する(このステップは時間の無駄で、3-5昼夜以上かかる)
    java -Xmx128G -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar HaplotypeCaller  -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 119-8_recal_reads.bam --dbsnp /home/guo/maize/zm437/zea_mays_vcfsort.vcf --native-pair-hmm-threads 96 -stand-call-conf 30 -O 119-8.g.vcf.gz -ERC GVCF
 
java -Xmx128G -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar HaplotypeCaller  -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -I 2447-20_recal_reads.bam --dbsnp /home/guo/maize/zm437/zea_mays_vcfsort.vcf --native-pair-hmm-threads 96 -stand-call-conf 30 -O 2447-20.g.vcf.gz -ERC GVCF

    1.2以前に生成されたGVCFファイルを1つのファイルにマージする.
    java -Xmx128G -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar CombineGVCFs -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa --dbsnp /home/guo/maize/zm437/zea_mays_vcfsort.vcf --variant 2447-20.g.vcf.gz --variant 119-8.g.vcf.gz -O cohort.g.vcf.gz

    1.3 GenotypeGVCFs 
    java -Xmx128G -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar GenotypeGVCFs -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -V cohort.g.vcf.gz -O common.vcf.gz

    2.select SNP 
    java -Xmx96g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar SelectVariants -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -O common_SNP.vcf --variant common.vcf.gz --select-type-to-include SNP  2>select_snp.err

    3.select indel 
    java -Xmx96g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar SelectVariants -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -O common_INDEL.vcf --variant common.vcf.gz --select-type-to-include INDEL  2>select_indel.err

    /#4.1および4.2変異フィルタリングは、異なるアルゴリズムのフィルタリングである.4.1は機械パラメータフィルタリング、4.2は機械学習フィルタリングである.どちらかを選択すると/4.1 filter SNP(変異フィルタ、ハードフィルタ)になります.パラメータの説明
    java -Xmx4g -jar $GATK -R $REF -T VariantFiltration --variant $Slect_SNP --clusterSize 4 --clusterWindowSize 10 --maskName aroundIndel --mask $Slest_INdel -maskExtend 3 --filterName "lowMQRankSum" --filterExpression "MQRankSum < -12.5" --filterName "highFS" --filterExpression "FS > 60.0" --filterName "lowReadPosRankSum" --filterExpression "ReadPosRankSum < -8.0" --filterName "lowMQ" --filterExpression "MQ < 40.0" --filterName "lowQD" --filterExpression "QD < 2.0" --out $Filter_SNP --genotypeFilterName "lowDP" --genotypeFilterExpression "DP < 8.0" >filter_snp.err

    java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar VariantFiltration -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa --variant common_SNP.vcf --cluster-size 4 --cluster-window-size 10 --mask-name aroundIndel --mask common_INDEL.vcf -mask-extension 3 --filter-name "lowMQRankSum" --filter-expression "QUAL < 30" --filter-name "qua130" --filter-expression "MQRankSum < -12.5" --filter-name "highFS" --filter-expression "FS > 60.0" --filter-name "lowReadPosRankSum" --filter-expression "ReadPosRankSum < -8.0" --filter-name "lowMQ" --filter-expression "MQ < 40.0" --filter-name "lowQD" --filter-expression "QD < 2.0" -O common_filtration.vcf --genotype-filter-name "lowDP" --genotype-filter-expression "DP < 8.0" >filter_snp.err

    パラメータの詳細(参照)
    以下のフィルタパラメータは,自分の実際のvcfの値に基づいて分布し,自分で修正することができる.
    QDは,単位深さの変異値を記述し,大きいほど信頼性が高い.一般に<2の値をフィルタします.FSは、正負鎖の特異性を記述し、差異が大きく、シーケンシングまたは組立の過程でランダムではないことを示している.FSは小さいほど良い.一般に、bwa−memを使用する場合、正常値は60であるべきであり、ある部位シーケンシングreadsの質量値の離散度を記述する.MQ<40.0 MQRankSum<-12.5 SORも、正負鎖特異性を表し、正常値が0-3、フィルタリング>3の値である.
    4.2変種質量制御VQSRは、2つのステップに分けられる(##このステップは本実験では適用されず、実行されていない.)
    /本実験では,このモデルを用いてフィルタリングすることはできず,このモデルは多様なvcf質量制御に適応している/
  • VariantRecalibratorは、フィルタリング(VariantRecalibrator)
    • のためにバリアント品質を評価するための再較正モデルを構築する.
  • 変異質量スコア再較正ApplyVQSR

    • VariantRecalibrator 
     gatk VariantRecalibrator \
   -R Homo_sapiens_assembly38.fasta \
   -V input.vcf.gz \
   --resource hapmap，known = false，training = true，truth = true，prior = 15.0：hapmap_3.3.hg38.sites.vcf.gz \
   --resource omni，known = false，training = true，truth = false，prior = 12.0：1000G_omni2.5.hg38.sites.vcf.gz \
   --resource 1000G，known = false，training = true，truth = false，prior = 10.0：1000G_phase1.snps.high_confidence.hg38.vcf.gz \
   --resource dbsnp，known = true，training = false，truth = false，prior = 2.0：Homo_sapiens_assembly38.dbsnp138.vcf.gz \
   -an QD -an MQ -an MQRankSum -an ReadPosRankSum -an FS -an SOR \
   -mode SNP
   -O output.recal \
   --tranches-file output.tranches \
   --rscript-file output.plots.R

    VQSR 
    gatk ApplyVQSR \
   -R Homo_sapiens_assembly38.fasta \
   -V input.vcf.gz \
   -O output.vcf.gz \
   --truth-sensitivity-filter-level 99.0 \
   --tranches-file output.tranches \
   --recal-file output.recal \
   -mode SNP

    java -Xmx128g jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ApplyVQSR -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -V 2447-20.vcf -O 2447-20.vqsr.vcf &
java -Xmx128g jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar ApplyVQSR -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -V 119-8.vcf -O 119-8.vqsr.vcf &
  • 変換vcfはtable形式
    • である.
    java -Xmx128g -jar /home/chaim/disk/gatk/gatk4/gatk-package-4.0.10.1-local.jar VariantsToTable -R /home/chaim/disk/zm437/Zea_mays.AGPv4.dna.toplevel.fa -V common_filtration.vcf -F CHROM -F POS -F REF -F ALT -GF AD -GF DP -GF GQ -GF PL -O common.table

    三、qtl-seqrパッケージ(第4ステップと同時に行うことができる)QTLseqrをgithubで使用する
    以下のコードはR言語コード
    #    QTL-seqr

#  
installed.packages('devtools')
library('devtools')
install_github("bmansfeld/QTLseqr")

#load the package
library("QTLseqr")

#set sample and file name 
HighBulk

    四.gatk 4出力のvcfはsnpEffを用いて処理される.snpEffのチュートリアル
  • ダウンロードsnpEffアドレス解凍unzip snpEff_latest_core.zip私の経路は/home/chaim/bsa/snpEff/
    • です
  • トウモロコシzm 437バージョンを構成するデータベースは、パス/home/chaim/bsa/snpEff/snpEff/ディレクトリの下にフォルダdata、
    • を作成します.
    cd /home/chaim/bsa/snpEff/snpEff/
mkdir data
cd data
mkdir genomes
mkdir zm437

# zm437           genes.gff,      ，protein.fa
# genomes            zm437.fa

    上記のゲノム注釈ファイルはgff 3フォーマットであることに注意してください.snpEffを修正します.configのパラメータは次のように追加されます.
    #maize genome,version zm437
 zm437.genome:maize

    snpEFFディレクトリに戻り、コマンドjava -jar snpEff.jar build -gff3 -v zm437を実行
  • vcf形式のファイルについて注記:bwaディレクトリにはGATK 4処理後のファイルcommon_filtration.vcfが格納されている/home/chaim/bsa/bwaディレクトリでは、次のコマンド
    • が実行する.
     java -Xmx128g -jar /home/chaim/bsa/snpEff/snpEff/snpEff.jar zm437 common_filtration.vcf > common.eff.vcf

    3つのファイルが出力されますsnpEff_genes.txt snpEff_summary.html common.eff.vcf
  • 他の注釈ファイルの使用を変更したい場合は、/home/chaim/bsa/snpEff/snpEff//data/zm437/snpEffectPredictor.binを削除して削除すればよい.手順1からやり直してください.
    • Androidではファイル形式でデータを保存
    C#6.0新特性の試み